常規(guī)的PCR擴(kuò)增需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒制備等多步操作后才能進(jìn)行基因擴(kuò)增,操作繁瑣耗時(shí)較長,同時(shí)在反復(fù)的操作中DNA量損失也較大,產(chǎn)率較低。在1989年 Gussow Clackson3建立了菌落PCR( colony PCR)法,菌落PR與我們通常的普通DNA的PCR的不同在于,直接以單個(gè)菌作為模板。是一種可以快速鑒定菌落是否為含目的質(zhì)粒的陽性菌落,操作簡單,快速,在轉(zhuǎn)化鑒定中較常用。
PCR原理
常規(guī)的PCR需要專門制備DNA模板,面菌落PCR可直接以單個(gè)菌落作為模板,用無菌牙挑取單個(gè)菌落到TE級沖液中,煮沸10mn,渦旋振蕩后短暫離心,用1-2pl裂解液作為DNA模板,省去抽提模板DNA這一步,通過特異性引物或通用引物對目的基因進(jìn)行快速擴(kuò)增大大節(jié)約了時(shí)間和成本
材料選擇
1.固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的單菌落
②10XPCR緩沖液(100mmol/ L. Tris-HCL, pH8.3,500 mmol/L KCL;0.1%明膠;15mmol/LMgCl2)。
③目的基因引物
④高壓滅菌牙簽
⑤抗性平板。
⑥ Triton x100
7.EP管
8.離心機(jī)
操作方法
①用高壓滅菌的牙簽挑取單個(gè)菌落,先在含抗性的平板上畫線,做保種用,然后將牙簽置于2 Intar×100中攪和一下,以便懸浮涂在牙簽上的菌,將相應(yīng)的菌和平板上的畫線區(qū)做上對應(yīng)的②將裝有20 u Triton×100的EP管煮沸10min,冷卻后120r/min離心lmin去除細(xì)胞
③反應(yīng)體系(25ul)
Taq酶(5U/ul） 0.5ul 引物P2(10umol/L） 0.5ul
10×Taq緩沖液 2. 5ul dNTPs(各 2. 5mmol/L) 2ul
模板
引物Pl(10mo/L) 0.5ul
④PR擴(kuò)增條件:95℃ 5min 94℃ 30s, 55℃ 30s,72℃ 60s,30循環(huán);72℃5min;4℃
⑤電泳,觀察結(jié)果,對陽性的結(jié)果相對應(yīng)的主平板上的菌落保種或者進(jìn)行測序。
注意事項(xiàng)
①菌落PCR時(shí),加入菌液模板的體積不能過大,否則會(huì)影響PCR體系,導(dǎo)致擴(kuò)增失敗,般取1~2l做25l的PCR體系,模板如果太多了,引物就不夠用了,顯然擴(kuò)增不出來,這種現(xiàn)象在以質(zhì)粒為模板的PCR里面很多,提出來的質(zhì)粒不要忘記稀釋
②減少擴(kuò)增循環(huán),25-30個(gè)循環(huán)對于菌落PCR是比較合適,擴(kuò)增循環(huán)過多,會(huì)產(chǎn)生假
③假陽性的控制。如果用載休引物來擴(kuò)增一般可以降低假陽性,或者多用幾對不同的引物擴(kuò)增,以增加真陽性的篩選結(jié)果,PCR結(jié)果最好做酶切鑒定
④PCR條件的控制。熱啟動(dòng)可以消除引物二聚體,退火溫度可以低
PCR應(yīng)用
1.挑取重組子克隆
常規(guī)的堿裂解和煮沸法( Sambrook,1989)12均需要經(jīng)過菌體過夜培養(yǎng)、菌體裂解及乙醇沉淀過程。一般情況下,在挑取的若干克隆中只有少部分為重組子,因此提取質(zhì)粒過程消耗的時(shí)間很多,而利用菌落PCR挑取重組子克隆的過程則避開了提取質(zhì)粒的繁瑣過程。陳淑霞等人口利用單菌落PCR法直接篩選含有綠色熒光蛋自基因( green fluorescent protein,GFP)和不耐熱腸毒素B亞基和耐熱腸毒素融合基因( LTB-ST)外源基因的重組克隆,陽性克隆可以擴(kuò)增出目的條帶,和質(zhì)粒PCR擴(kuò)增進(jìn)行比較結(jié)果一致。證明單菌落PCR進(jìn)行重組菌陽性克隆的鑒定是非常有效的
2.基因組測序
傳統(tǒng)的測序首PCR擴(kuò)增是以堿裂解等方法抽提的DNA為模板,成功率高但較為繁瑣,采用菌落PCR方法,將樣品跳過DNA抽提這一步,直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光標(biāo)記,使建庫到測序前各步驟的總成本減少了1/3,唐曄盛等釆用該法成功測定了秈稻( Oryza sativa indica)廣陸矮4號(hào)的L173號(hào) BAC DNA全長序列
總結(jié)
常規(guī)PCR技術(shù)是目前分子生物學(xué)中的一種常用的鑒定方法和技術(shù)手段,在嚴(yán)格操作的前提下,PCR的結(jié)果是十分可靠的,但常規(guī)PCR擴(kuò)增需要一些前期準(zhǔn)備工作,如DNA模板的制備與純化,操作繁瑣,耗時(shí)費(fèi)力,成本較高,而且DNA制備過程中的某些試劑會(huì)對擴(kuò)增帶來不良影響。因此,菌落PCR為簡便快速地篩選DNA陽性重組克隆以及大規(guī)模基因測序等提供了一個(gè)簡便、高效的途徑.
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