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還原糖和總糖的測定實驗原理和步驟
點擊次數:1053 更新時間:2024-06-05

實驗方法原理:

各種單糖和麥芽糖是還原糖,蔗糖和淀粉是非還原糖。利用溶解度不同,可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來,再用酸水解法使沒有還原性的雙糖和多糖徹di底水解成有還原性的單糖。在堿性條件下,還原糖將3,5-二硝基水楊酸還原為3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色物質),還原糖則被氧化成糖酸及其它產物,在一定范圍內,還原糖的量與棕紅色物質深淺的程度呈一定的比例關系,在540nm 波長下測定棕紅色物質的消光值,查對標準曲線并計算,便可分別求出樣品中還原糖和總糖的含量。多糖水解時,在單糖殘基上加了一分子水,因而在計算中須扣除已加入的水量,測定所得的總糖量乘以0.9 即為實際的總糖量。

實驗步驟:

一、實驗材料、儀器和試劑

1、實驗材料:面粉。

2、儀器: (1) 25ml 血糖管或刻度試管×11;(2) 大離心管或玻璃漏斗×2;(3) 燒杯:100ml×1;(4) 三角瓶:100ml×1;(5) 容量瓶:100ml×3;(6) 刻度吸管:1ml×11、2ml×4、10ml×1;(7) 恒溫水浴;(8) 沸水浴;(9) 離心機(過濾法不用此設備);(10)電子天平;(11)分光光度計;

3、試劑:

(1) 1mg/ml葡萄糖標準液:準確稱取 100 mg分析純葡萄糖(預先在 80 ℃烘至衡重),置于小燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,定量轉移至100ml的容量瓶中,以蒸餾水定容至刻度,搖勻,冰箱中保存備用。

(2) 3,5-二硝基水楊酸試劑:將6.3g 3,5-二硝基水楊酸和262ml 2NNaOH 溶液,加到500ml含有185g酒石酸甲鈉的熱水溶液中,再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉,攪拌溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000ml,貯于棕色瓶中備用。

(3) 碘-碘dian化鉀溶液:稱取5g碘和10g碘dian化鉀,溶于100ml 蒸餾水中。

(4) 酚fen酞指示劑:稱取0.1g酚fen酞,溶于250ml 70%乙醇中。

(5) 6NHCl

(6) 6NNaOH


二、操作步驟

1、制作葡萄糖標準曲線:

取7支具有25ml刻度的血糖管或試管,編號,按下表所示的量,精確加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標準液和3,5-二硝基水楊酸試劑。

圖片.png

將各管搖勻,在沸水浴中加熱5分鐘,取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫,再以蒸餾水定容至25ml刻度處,用橡皮塞塞住管口,顛倒混勻(如用大試管,則向每管加入21.5ml蒸餾水,混勻)。在540nm波長下,用0號管調零,分別讀取1-6號管的消光值。以消光值為縱坐標,葡萄糖毫克數為橫坐標,繪制標準曲線。

2、樣品中還原糖和總糖的測定:

(1)樣品中還原糖的提取:

準確稱取2g食用面粉,放在100ml的燒杯中,先以少量的蒸餾水調成糊狀,然后加50ml蒸餾水,攪勻,置于50℃恒溫水浴中保溫20分鐘,使還原糖浸出。離心或過濾,用20ml蒸餾水洗殘渣,再離心或過濾,將兩次離心的上清液或濾液全部收集在100ml的容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,混勻,作為還原糖待測液。

(2)樣品中非還原糖的水解和提取:

準確稱取1 g食用面粉,放在100ml 的三角瓶中,加入10 ml 6NHCl及15ml 蒸餾水,置于沸水浴中加熱水解30分鐘。取1~2 滴水解液于白瓷板上,加1滴碘-碘dian化鉀溶液,檢查水解是否完wan全。如已水解完wan全,則不顯藍色。待三角瓶中的水解液冷卻后,加入一滴酚fen酞指示劑,以6NNaOH中和至微紅,過濾,再用少量蒸餾水沖洗三角瓶及濾紙,將濾液全部收集在100ml的容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,混勻。精確吸取10ml定容過的水解液,移至另一100ml的容量瓶中,定容,混勻,作為總糖待測液。

(3)顯色和比色:

取5支25ml刻度的血糖或刻度試管,編號,按下表所示的量,精確加入待測液和試劑。

圖片.png

注意事項:

圖片.png

其他:

1、用血糖管比大試管方便。

2、離心比過濾易得清液。

3、標準曲線制作與樣品含糖量測定應同時進行,一起顯色和比色

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