葡萄糖-6-磷酸酶染色液(鉛法)操作說(shuō)明
產(chǎn)品組成：
試劑(A): G-6-Pase 孵育液 50ml 4℃ 避光
試劑(B): ALP 硫化溶液 2×1ml RT 避光
試劑(C): 中性福爾馬林 50ml 4℃ 避光
試劑(D): G-6-Pase 對(duì)照液 10ml 4℃ 避光
使用說(shuō)明書(shū) 1 份
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6 –phosphatase，G-6-Pase)是一種多存在于哺乳類(lèi)動(dòng)物肝、腎、腸等組織的膜結(jié)合酶，G-6-Pase 和微體緊密結(jié)合，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要標(biāo)志酶，能把葡萄糖-6-磷酸水解成葡萄糖和磷酸。G-6-Pase 對(duì)維持血糖濃度的相對(duì)恒定有至關(guān)重要的作用，是糖代謝的關(guān)鍵酶。當(dāng)血糖降低時(shí)，G-6-Pase 促進(jìn)肝糖原轉(zhuǎn)變?yōu)檠?。?dāng)缺乏G-6-Pase 時(shí)，會(huì)引起糖原分解障礙，使糖原積累在肝、腎、心臟等部位，導(dǎo)致肝糖原儲(chǔ)積病。G-6-Pase zui適pH 為6.5，在pH6.0～8.0 亦可，pH8.0 zui穩(wěn)定，pH5.0易變性。組織化學(xué)反應(yīng)多用pH6.5～6.7。
葡萄糖-6-磷酸酶染色液(鉛法)采用重金屬捕捉劑和磷酸結(jié)合顯示酶的活性。該酶對(duì)固定很敏感，組織經(jīng)80%乙酸溶液固定后用石蠟包埋，G-6-Pase *被抑制。需用新鮮組織低溫恒冷切片，經(jīng)甲醛短時(shí)固定酶即失活，但可短時(shí)低溫丙酮固定，但一般不固定。
操作步驟(僅供參考)：
1、冰凍切片入蒸餾水清洗。
2、入G-6-Pase 孵育液，37℃孵育15～20min。
3、自來(lái)水沖洗后，蒸餾水沖洗。
4、在上述過(guò)程中配制ALP 硫化工作液，即取試劑(B)用蒸餾水稀釋50 倍, 即為ALP 硫化工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育1min。
5、自來(lái)水水洗3～5min。
6、(可選)入中性福爾馬林，固定2min。
7、入蒸餾水水洗2 次。
8、甘油明膠封片
鉛法：葡萄糖-6-磷酸水解后所釋放出磷酸，為*所捕獲，經(jīng)硫化銨處理，zui終反應(yīng)產(chǎn)物為顆粒狀的硫化鉛沉淀。反應(yīng)通式如下：
葡萄糖―6―磷酸鈉+H2 O 葡萄糖 -6- 磷酸酶 葡萄糖+磷酸 Pb(NO3 )2 Pb3 (PO4 )2 (NH4 )2 S PbS↓
1)孵育液配制(新鮮配制)
0．125％葡萄糖―6―磷酸鈉 4ml
0．2mol/LTris-順丁烯二酸鹽緩沖液(pH 7．4) 4ml
2％Ph(N03 )2 (2．5％) 0.6ml
蒸餾水 1．4ml
充分混合后使用
2)染色程序：
①新鮮組織冰凍切片；
②10％福爾馬林固定5分鐘后水洗；
③切片入孵育液中，37℃孵育20分鐘水洗；
④人1％硫化銨水溶液中1分鐘水沖洗；
⑤3％福爾馬林后固定10分鐘；
⑥甘油明膠封固。
3)結(jié)果：酶活性處顯棕色。
4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：①除去底物；②以F―甘油磷酸鈉代替底物；③以0．01mol/L氟化鈉作為抑制劑。
