已經(jīng)提出過許多方法用于從細菌中提純質(zhì)粒DNA， 這些方法都含有以下3個步驟：
    細菌培養(yǎng)物的生長。
    細菌的收獲和裂解
    質(zhì)粒DNA的純化。

    （一）細菌培養(yǎng)物的生長
    從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當抗生素的液體培養(yǎng)基中生長)，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此。現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標準LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時，不必造反性地擴增質(zhì)粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入lv霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對質(zhì)粒進行性擴增。lv霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR３２２－類的質(zhì)粒，從經(jīng)lv霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的lv霉素μg/ml)已成為標準的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。

    （二）細菌的收獲和裂解
    細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于３個因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精que的裂解條件不切實際，但仍可據(jù)下述一般準則來選擇適當方法，以取得滿意的結(jié)果。
    1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。
    2)可用geng劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。
    3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當隨后用lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時，不宜使用煮沸法。
    4)當從表達內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能*滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質(zhì)粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：lv仿進行抽提)可以避免此問題。
    ５)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用lv霉素進行選擇性擴增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用lv霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數(shù)中期在增減物中加入lv霉素可以避免這種現(xiàn)象。有l(wèi)v霉素存在時從較少量細胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加lv霉素時從較大量細胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。

    (三)質(zhì)粒DNA的純化
    常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如，用lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合geng多的染料，直至達到飽和( 每２個堿基對大約結(jié)合１個溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的lv化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的shou選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒。另外，現(xiàn)在已可買到現(xiàn)成的純化KIT。

    二、質(zhì)粒DNA的小量制備
    細菌的收獲和裂解
    收獲
    堿裂解法
    煮沸裂解
    質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策
    質(zhì)粒ＤＮＡ的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法

    （一）細菌的收獲和裂解
    １．收獲
    １）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。
    ２）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
    ３）吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
    ２．堿裂解法
    １）將細菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。
    溶液Ｉ
    50mmol/L葡萄糖
    25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)
    10mmol/LEDTA(pH8.0)
    溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。
    ２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
    溶液Ⅱ
    0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
    1%SDS
    蓋緊管口，快速顛倒離心管５次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面
    均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
    ３）加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ
    溶液Ⅲ
    5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml
    冰乙酸 11.5ml
    水 28.5ml
    所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。
    蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后
    將管置于冰上３－５分鐘。
    ４）用微量離心機于4℃12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
    ５）可做可不做：加等量酚：lv念， 振蕩混勻， 用微量離心機于4 ℃以12000g離心
    ２分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認為不*酚：lv仿進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。
    ６）用２倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置２分鐘。
    ７）用微量離心機于4℃以12 000g離心５分鐘。
    ８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡量使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
    ９）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。
    i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細菌培養(yǎng)物3－5μg。
    ii．如果要通過限制酶切割反應(yīng)來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和１單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時。將剩余的DNA貯存于－20℃。
    iii.此方法按適當比例放大可適用于100ml細菌培養(yǎng)物：

    ３．煮沸裂解
    １）將細菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。
    STET
    0.1mol/L NaCL
    10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
    1mmol/L EDTA(pH8.0)
    5% Triton X-100
    ２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。
    ３）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。
    ４）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。
    ５）用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。
    ６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。
    ７）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。
    ８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。
    ９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。
    10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體（2－5）分鐘。
    11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。
    注：當從表達內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下溫育（V中用限制酶時）質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：lv仿進行抽提，可以避免這一問題。