單克隆抗體一直是基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和疾病治療中的重要工具。制備單克隆抗體的傳統(tǒng)方法，是諾貝爾獎獲得者Georges Khler和César Milstein在上世紀(jì)七十年代-開發(fā)出來的。這一方法包括：讓小鼠接觸特定抗原，收集它體內(nèi)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成能夠長時間體外培養(yǎng)的雜交瘤。這種技術(shù)可以幫助人們生產(chǎn)大量高度特異性的抗體。

然而，動物源的抗體不能用于人體治療，因?yàn)樗鼈儠|發(fā)人體的免疫反應(yīng)。為了在人體免疫細(xì)胞應(yīng)答特定病原體時，獲取細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，科學(xué)家們又開發(fā)了一些新的方法。例如，從血樣中分離記憶性B細(xì)胞，然后利用Epstein-Barr感染使這些細(xì)胞具有永生能力，再在其中篩選能夠生成特異性抗體的細(xì)胞。“這個方法非常費(fèi)勁，因?yàn)槟阋苽溥@些細(xì)胞系，對大量的細(xì)胞進(jìn)行篩選，”芝加哥大學(xué)的免疫學(xué)副教授Patrick Wilson說。另外，不是所有的細(xì)胞都能在永生化過程中存活下來，這無疑限制了天然抗體的產(chǎn)量。

近Wilson等人找到了一個新辦法，他們從活躍應(yīng)答病原體或疫苗的人類血液中，分離具有抗原特異性的單個B細(xì)胞，然后對細(xì)胞中編碼抗體重鏈和輕鏈的兩個基因進(jìn)行克隆。這些基因的序列在不同細(xì)胞中是有差異的，“不能把細(xì)胞混在一起，因?yàn)槟菢幽憧赡艿玫揭粋€細(xì)胞的重鏈和另一個細(xì)胞的輕鏈”，這樣就不能獲得天然的重輕鏈組合。克隆了兩個基因之后，就可以在此基礎(chǔ)上生產(chǎn)重組抗體，這一技術(shù)也被稱為表達(dá)克隆（expression cloning）。“這個技術(shù)沒什么限制，只要分離到B細(xì)胞就可以制造相應(yīng)的抗體，”Wilson說。“問題在于實(shí)驗(yàn)的步驟比較繁瑣。”

表達(dá)克隆法-適合“在獲得了大量抗原特異性細(xì)胞時使用，而這些細(xì)胞只有在疫苗接種或感染之后才會出現(xiàn)，”Wilson說。如果沒有產(chǎn)生活躍的免疫應(yīng)答，這個技術(shù)鑒定抗體就會非常吃力。因?yàn)檠褐写嬖谥鴶?shù)百萬記憶性B細(xì)胞，它們都針對著不同的抗原。

上述技術(shù)都是鑒定新抗體和研究人類免疫應(yīng)答的寶貴工具，不過這些技術(shù)都很耗時也比較復(fù)雜。為了加快抗體研發(fā)的速度，The Scientist雜志聯(lián)-系了相關(guān)領(lǐng)域的一些專家，請他們分享了自己使用新興技術(shù)進(jìn)行抗體鑒定和分離的經(jīng)驗(yàn)。

基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法!--xml:namespace prefix = "o" ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /--

使用者：NIH國家過敏與傳染病研究所的Mark Connors

項(xiàng)目：分離廣譜而且強(qiáng)效的新HIV中和抗體

遇到的問題：HIV患者的抗體生產(chǎn)細(xì)胞永生化效率較低，就算成功永生化，一些克隆也并不穩(wěn)定。此前有研究者通過熒光探針從血樣中提取抗原特異性的記憶性B細(xì)胞，并由此獲得HIV中和抗體。Connors及其團(tuán)隊希望在不依賴已知抗原的條件下，尋找新的HIV中和抗體。（延伸閱讀：PNAS：常用HIV藥物難以深入淋巴組織）

解決辦法：Connors及其團(tuán)隊首先使用流式細(xì)胞儀從HIV感染者的血液中分離B細(xì)胞。他們并沒有采用常規(guī)的表達(dá)克隆（克隆各個細(xì)胞的重鏈和輕鏈基因），而是將分離到的細(xì)胞分裝在384孔板中。他們用滋養(yǎng)層細(xì)胞和信號分子保持B細(xì)胞的活性，同時刺激它們分泌抗體。在大約兩周后，研究人員檢驗(yàn)了每個孔上清液在體外中和HIV的能力。隨后，他們選取了有中和能力的細(xì)胞，并對其中的抗體基因進(jìn)行克隆，后制成重組抗體。Connors和他的團(tuán)隊用這一方法，分離了兩個能夠強(qiáng)力中和多種HIV病毒株的新抗體。

優(yōu)點(diǎn)：

使用者不需要事先知道抗體的結(jié)合特異性

可以用于多種疾病。“只要你有能夠進(jìn)行篩選的目標(biāo)功能，就可以提取抗體，” Connors說。

完成整個過程只需要三周，Connors說。

滋養(yǎng)層細(xì)胞可以通過AIDS reagent program免費(fèi)得到

缺點(diǎn)：

中和分析所需的試劑比較貴

理論上這一方案可以手動完成，但需要篩選的孔很多（Connors篩選了60,000–140,000個孔），因此這一技術(shù)更適合擁有自動化液體處理設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室。

一些抗體生產(chǎn)細(xì)胞可能在培養(yǎng)過程中無法存活。

成本：據(jù)Connors估計，每個384孔板大約需要$400–$500。手動操作一般需要約20塊板，自動化實(shí)驗(yàn)操作一般需要60–80塊板，具體還是要看血樣中有多少B細(xì)胞。

高通量DNA測序

使用者：德克薩斯大學(xué)的George Georgiou教授

項(xiàng)目：用高通量測序鑒定天然的人類抗原特異性抗體

遇到的問題：2010年Georgiou的研究團(tuán)隊向人們展示，可以通過免疫球蛋白基因的高通量測序，快速生產(chǎn)抗原特異性的抗體。隨后，研究團(tuán)隊對小鼠進(jìn)行免疫接種，然后選取了抗體生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)量-為豐富的重鏈和輕鏈基因，將它們重組成為抗體。但這一方法無法辨別抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的原始重/輕鏈配對。Georgiou發(fā)現(xiàn)，要想構(gòu)建天然抗體，就要找到同時測序重鏈和輕鏈的方法。

解決辦法：Georgiou的研究團(tuán)隊先用流式細(xì)胞儀從血液中純化B細(xì)胞，將細(xì)胞一個個分配到125皮升的微孔中。隨后他們裂解細(xì)胞，并用磁性微珠捕獲重鏈和輕鏈的可變區(qū)mRNA（VH 和VL）。對這些mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以將VH和VL轉(zhuǎn)錄本結(jié)合在一起形成一個cDNA擴(kuò)增子。在此基礎(chǔ)上，研究人員可以通過測序和生物信息學(xué)分析來確定VH: VL的配對情況。

研究人員利用這一技術(shù)，在應(yīng)答破傷風(fēng)類毒素的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中鑒定了86個重/輕鏈對。他們選擇其中的10對制備了10種重組抗體，結(jié)果這些抗體都能夠在體外與破傷風(fēng)類毒素高親和力結(jié)合。而之前的研究顯示，通過重鏈和輕鏈隨機(jī)配對生產(chǎn)的抗體，只有大約10%具備抗原特異性。

優(yōu)點(diǎn)：

非常快。“從分離細(xì)胞到獲得全天然的人類重/輕鏈序列，只需要一周時間，”DeKosky說。

可以鑒定抗體的天然序列

不會漏掉罕見B細(xì)胞所編碼的免疫球蛋白

可以在免疫應(yīng)答的過程中跟蹤B細(xì)胞的發(fā)育

缺點(diǎn)：

需要自制微孔芯片

進(jìn)行序列分析需要具備一定的生物信息學(xué)知識

成本：據(jù)DeKosky介紹，獲得2,700對抗體基因序列，需要大約$550的試劑。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

使用者：CST公司的首-席科學(xué)家Roberto Polakiewicz

項(xiàng)目：鑒定實(shí)際存在于人類和動物血液中的抗體，并在此基礎(chǔ)上生產(chǎn)具有高親和力的重組抗體

遇到的問題：以細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗體制備策略（不論是B細(xì)胞永生化、表達(dá)克隆還是測序）都不能代表血液中真實(shí)存在的所有抗體。這是因?yàn)椋行┘?xì)胞會在分離過程中死亡，而有些細(xì)胞編碼的抗體可能并不釋放到血液中去。“我們制備抗體的目的是對抗感染，” Polakiewicz說，所以“真正重要的是血液循環(huán)中的抗體，這些抗體才負(fù)責(zé)發(fā)現(xiàn)病原體并召集免疫細(xì)胞展開攻擊。”為此，Polakiewicz及其同事希望開發(fā)一個策略，直接分析血液循環(huán)中的抗體。

解決方法：Polakiewicz的研究團(tuán)隊采用了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。他們先通過親和純化，從接種過乙肝疫苗的血液中分離和富集特異性的抗體。隨后，研究團(tuán)隊用蛋白酶將這些抗體消化成多肽片段，并對它們進(jìn)行質(zhì)譜分析。為了解讀這些質(zhì)譜數(shù)據(jù)，研究人員測序了供體B細(xì)胞的抗體基因，并在此基礎(chǔ)上建立了參考數(shù)據(jù)庫。“不能使用整個基因組，” Polakiewicz說。“那樣會給你生-殖細(xì)胞系的B細(xì)胞序列，而我們需要的是免疫接種后從頭生成的序列。”

通過比較免疫球蛋白的基因序列與多肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，研究人員鑒定和克隆了血液中的抗體重/輕鏈基因，并由此生產(chǎn)了多種重組抗體，這些抗體都能與乙肝病毒抗原高親和力的結(jié)合。

優(yōu)點(diǎn)：

能夠分析人體血液循環(huán)中出現(xiàn)的抗體成分

可以用來跟蹤血液抗體譜發(fā)生的變化

缺點(diǎn)：

需要自制進(jìn)行多肽和基因序列分析的生物信息學(xué)軟件

破壞了血液中抗體重/輕鏈的天然配對。

需要使用者具備測序和質(zhì)譜的專業(yè)知識

比較費(fèi)力，生成功能性的重組單克隆抗體需要21天

成本：Polakiewicz未能估算出這一方案的具體成本，但他指出這一方案的花銷跟常用的方法差不多，甚至還可能更低一些。