蛋白表達(dá)是指用模式生物如細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或者植物細(xì)胞表達(dá)外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系，通過這個(gè)體系可以實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主中表達(dá)的目的。

1、宿主。表達(dá)蛋白的生物體。可以為細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達(dá)蛋白的種類也不相同。

2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據(jù)宿主不同，分為原核（細(xì)菌）表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導(dǎo)，外源基因可以在宿主中表達(dá)。

3、輔助成分。有的表達(dá)系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進(jìn)入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達(dá)體系中的桿狀病毒。

一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以其細(xì)胞繁殖快速產(chǎn)量高、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相對(duì)簡便等優(yōu)點(diǎn)成為生產(chǎn)重組蛋白的最chang用的系統(tǒng)。目前最chang用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為BL21-PET表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)目前已經(jīng)商業(yè)化，并且普遍應(yīng)用于各大實(shí)驗(yàn)室和生物技術(shù)公司。

對(duì)于表達(dá)不同的蛋白，需要采用不同的載體。目前已知的大腸桿菌的表達(dá)載體可分為非融合型表達(dá)載體和融合型表達(dá)載體兩種。非融合表達(dá)是將外源基因插到表達(dá)載體強(qiáng)啟動(dòng)子和有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達(dá)產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達(dá)是將目的蛋白或多肽與另一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內(nèi)表達(dá)。融合型表達(dá)的載體包括分泌表達(dá)載體、帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體、表面呈現(xiàn)表達(dá)載體、帶伴侶的表達(dá)載體。

優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚；繁殖快、成本低、抗污染能力強(qiáng)；表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對(duì)簡單、穩(wěn)定性好；商品化的載體和菌株種類非常齊全、適用范圍廣等。

缺點(diǎn)：

① 沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行mRNA的剪接，所以只能表達(dá)cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因；

② 沒有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對(duì)和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學(xué)活性；

③ 表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體，尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成快速太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導(dǎo)致疏水基因外露等。細(xì)菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無生物活性的不溶性蛋白，要經(jīng)過復(fù)性，使其重新散開、重新折疊成具有天然蛋白構(gòu)象和良好生物活性的蛋白質(zhì)，常常是一件很困難的事情。也可以設(shè)計(jì)載體使大腸桿菌分泌表達(dá)出可溶性目的蛋白，但表達(dá)量往往不高。

④ 可能會(huì)產(chǎn)生一些致熱源(內(nèi)毒素)，并且大腸桿菌本身含有內(nèi)毒素和有毒蛋白，可能混雜在終產(chǎn)物里。

二、酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用，應(yīng)用此系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認(rèn)可為一種表達(dá)大規(guī)模蛋白的強(qiáng)有力的工具。

常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用*泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬應(yīng)用最多。

優(yōu)點(diǎn)

1. 生長方面：酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖快速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)有效降低了生產(chǎn)成本。畢赤酵母具有強(qiáng)烈的好氧生長偏愛性，可進(jìn)行細(xì)胞高密度培養(yǎng)，利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

2. 安全性方面：釀酒酵母被認(rèn)為是安全無毒的，有著數(shù)十年的大規(guī)模發(fā)酵研究基礎(chǔ)。

3. 分子生物學(xué)操作方面：釀酒酵母在重組DNA中的廣泛研究也是基于其己被人們掌握的大量分子生物學(xué)及生理學(xué)信息。外源基因一般和表達(dá)載體一起整合到了酵母染色體上，隨染色體一起復(fù)制和遺傳，不會(huì)發(fā)生外源基因的丟失現(xiàn)象。

4. 蛋白表達(dá)方面：可以進(jìn)行蛋白的糖基化，而且還能分泌重組蛋白。

5. 蛋白分泌方面：由于畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白很少，因此純化方便。

缺點(diǎn)

1. 克隆基因的表達(dá)量低，發(fā)酵時(shí)間長，不正確的蛋白糖基化及抗細(xì)胞分裂。

2. 培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。

三、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%；可表達(dá)非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力；對(duì)脊椎動(dòng)物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細(xì)胞則來源于草地夜蛾Sf9細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的質(zhì)粒來源于PUC系列，其含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)和多角體蛋白啟動(dòng)子。

桿狀病毒系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

1．組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配

2．蛋白翻譯后的加工修飾

3．表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白量的50%

4．可容納大分子的插入片段

5．能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。

主要缺點(diǎn)是外源蛋白表達(dá)處于極晚期病毒啟動(dòng)子的調(diào)控之下，這時(shí)由于病毒感染，細(xì)胞開始死亡。

四、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞需幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間，而利用病毒表達(dá)系統(tǒng)則可快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達(dá)產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體必須包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等控制元件。

根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時(shí)空差異，可將表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時(shí)、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是指宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)限短暫;瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是簡捷，實(shí)驗(yàn)周期短。穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是指載體進(jìn)入宿主細(xì)胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)持久、穩(wěn)定。由于需抗性選擇甚至加壓擴(kuò)增等步驟，穩(wěn)定表達(dá)相對(duì)耗時(shí)耗力。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是指目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導(dǎo)后才得以開放。采用異源啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和可擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，可提高蛋白產(chǎn)量。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH/3T3等，不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細(xì)胞時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況而定。

優(yōu)點(diǎn)

1. 蛋白活性：由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等。

2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的最da優(yōu)點(diǎn)是正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)（如糖基化）。

3. 哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)在蛋白的起始信號(hào)、加工、分泌、糖基化方面具有*優(yōu)勢，適合表達(dá)完整的大分子蛋白。

缺點(diǎn)

培養(yǎng)基成本*，培養(yǎng)周期長，至少一個(gè)月以上，培養(yǎng)較困難，表達(dá)量較低。

構(gòu)成復(fù)雜、操作技術(shù)要求高、表達(dá)產(chǎn)量不大、產(chǎn)率低，且有時(shí)會(huì)導(dǎo)致病毒感染。