一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒有酶的催化反應(yīng)，植物的生命也就停止了，因此對(duì)酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來(lái)，加以分離、純化，不同的研究目的對(duì)酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據(jù)不同情況區(qū)別對(duì)待。在酶的提取和純化過(guò)程中，自始至終都需要測(cè)定酶的活性，通過(guò)酶活性的測(cè)定以監(jiān)測(cè)酶的去向。

二、實(shí)驗(yàn)原理

（一）酶的提取

1.酶的存在位置？

存在于動(dòng)植物以及微生物的細(xì)胞的各個(gè)部位。

2.如何將酶從細(xì)胞中分離？

從高等植物中提取酶常遇到一些實(shí)際問(wèn)題，首先是細(xì)胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低。此外，各種酶的存在狀態(tài)不同，有在細(xì)胞外的外酶，在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)酶，內(nèi)酶中又有與細(xì)胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中，提取時(shí)都應(yīng)區(qū)別對(duì)待，作不同處理。如果酶僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，只要將細(xì)胞破碎，酶就會(huì)轉(zhuǎn)移到提取液中；但如果是與細(xì)胞器（如細(xì)胞壁、細(xì)胞核、線粒體、原生質(zhì)膜、微粒體等）緊密結(jié)合的酶，這時(shí)如僅僅破碎細(xì)胞還不夠，還需要用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來(lái)。其次，細(xì)胞中存在抑制物質(zhì)，如酚，酸，離子等，它們通常在液泡中，當(dāng)細(xì)胞破碎時(shí)，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細(xì)胞中釋放出來(lái)，進(jìn)入提取液中，特別是酚類物質(zhì)，具有游離的酚羥基，能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強(qiáng)的氫鍵，不能為一般的實(shí)驗(yàn)方法，如透析和凝膠過(guò)濾所解離。酚易氧化產(chǎn)生醌，醌為一種強(qiáng)氧化劑，會(huì)使蛋白質(zhì)的功能團(tuán)發(fā)生氧化或發(fā)生聚合，使蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基團(tuán)，如—SH，—NH2，通過(guò)1，4—加成反應(yīng)而發(fā)生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物組織和提取液產(chǎn)生棕色，以致影響酶活性的測(cè)定。因此如果沒有特殊需要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過(guò)程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液，因?yàn)樵诟遬H值時(shí)，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強(qiáng)的氫鍵，但高pH值促進(jìn)酚類氧化，同時(shí)降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已經(jīng)知道PVP能與游離酚羥基形成強(qiáng)的氫鍵復(fù)合物，是酚類化合物的有效結(jié)合劑。在提取線粒體時(shí)加入可溶性PVP，提取可溶性酶時(shí)加入不溶性交聯(lián)PVP（Polyvinyl polypyrrolidone，簡(jiǎn)稱PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體，可加10% HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應(yīng)用。

植物細(xì)胞有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，需要強(qiáng)烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動(dòng)勻漿器。為減低研磨或勻漿過(guò)程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘?jiān)偬崛∫淮巍Ｌ崛驖{時(shí)加入酚類結(jié)合劑PVPP，金屬螯合劑 Na2─EDTA，以及─SH化合物以保護(hù)蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如Triton X─100，以增加蛋白質(zhì)的可溶度，常用于與膜脂結(jié)合的酶?？傊?，可以通過(guò)試驗(yàn)以確定提取蛋白質(zhì)的最佳條件。

（二）分離和純化

1.酶的粗提液是否只有酶，有沒有其它物質(zhì)？

上面制備得到的提取液中，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。

2. 如何將酶從粗提液只分離純化？

要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法，往層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級(jí)鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質(zhì)的酶活性最大。大多數(shù)酶的活性存在于35梍45%和45梍55%飽和度硫酸銨沉淀的部分，但也有存在于65梍80%飽和度的（如花椰菜根的過(guò)氧化物酶）。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集之，再溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過(guò)濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì)，然后再經(jīng)過(guò)柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾柱層析等。對(duì)于不同的支持物采用的洗脫方法也不同，分子篩類型凝膠過(guò)濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫。對(duì)于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯度溶液進(jìn)行洗脫，最/方便的是線性梯度濃度，當(dāng)然用非線性梯度會(huì)得到更好的分離效果。柱層析一般都需要自動(dòng)收集儀，如果能配用蛋白質(zhì)檢測(cè)儀就更好了。目前柱層析和硫酸銨分級(jí)沉淀一樣，已經(jīng)成為一種常規(guī)的酶的分離提純的步驟之一了。

近年來(lái)純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來(lái)分離、提純酶。首先選擇一支持物，如瓊脂糖（Sepharose）將底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或輔酶，以共價(jià)鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過(guò)裝有專一性底物、競(jìng)爭(zhēng)抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再經(jīng)過(guò)充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì)，然后用含有一定濃度的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或輔酶的緩沖液，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。如果親和劑選擇合適，往往能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又*的一種方法。

（三）酶活力的測(cè)定

酶的活力表現(xiàn)為催化某一反應(yīng)的速度，反應(yīng)速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來(lái)表示。由于酶的催化作用和周圍環(huán)境的關(guān)系十分密切，環(huán)境的溫度、pH、離子強(qiáng)度等都對(duì)酶的活力有很大的影響，因此測(cè)定酶活力時(shí)應(yīng)該使這些條件保持恒定。

酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產(chǎn)物量）μmol數(shù)表示之。測(cè)定酶活性的方法很多，常因反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同可選用不同的方法，應(yīng)用*泛的是比色法或分光光度法。凡反應(yīng)系統(tǒng)中的化合物在紫外區(qū)或可見光區(qū)有吸收峰的都可以用這種方法進(jìn)行測(cè)定。如果酶催化的是一需氧反應(yīng)，如氧化酶，則可用測(cè)壓法或氧電極法。如果催化的反應(yīng)系統(tǒng)中需要ATP或產(chǎn)生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脫氫酶和氧化還原酶；或者反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，如一些氧化酶，這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行測(cè)定。總之，測(cè)定酶活性的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的方法。

三、材料、儀器與試劑

要求用硫酸銨分級(jí)沉淀部分純化過(guò)氧化物酶。

（一）、材料：花椰菜根

（二）、儀器（儀器的選擇在實(shí)驗(yàn)開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定）

冰凍離心機(jī)；751型分光光度計(jì)；電磁攪拌器；組織搗碎機(jī)；天平；量筒；移液管；燒杯；透析袋。

（三）、試劑（試劑的選擇在實(shí)驗(yàn)開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定后并配制）

PVPP；硫酸銨；0.02mol/L KH2PO4溶液；0.lmol/L 磷酸鉀緩沖液，PH6.0。

四、實(shí)驗(yàn)操作

(1)酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自來(lái)水洗凈，吸干水分，稱得鮮重，按每g5ml提取溶液，加入預(yù)冷的0.02mol/L KH2PO4溶液，加入材料鮮重10%PVPP（預(yù)先經(jīng)過(guò)純化，用蒸餾水吸脹）。在預(yù)冷的組織搗碎機(jī)中攪成勻漿。勻漿倒在燒杯中，于冰箱中浸提1小時(shí)，用 4層紗布或尼龍布袋過(guò)濾，濾液于18000r/min冷凍離心15分鐘，棄去沉淀，上清液即為酶的粗提取液。

(2)硫酸銨分級(jí)沉淀：用量筒量得酶液的體積，吸取5ml留作酶活性及蛋白質(zhì)含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固體硫酸銨，使達(dá)35%飽和度（參閱附表8），加硫酸銨時(shí)要緩慢，以避免造成局部濃度過(guò)高，在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入。然后置冰箱中半小時(shí)，離心如上。分別收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸銨使達(dá)65%飽和度，再離心，收集沉淀和上清液。按這樣的方法分別收集0梍35%、35梍65%、65梍80%、80梍100%飽和度硫酸銨沉淀。每部分沉淀分別復(fù)溶于1/20原始提取液體積的0.02mol/L KH2PO4溶液中，裝入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中進(jìn)行透析過(guò)夜，其間更換KH2PO4溶液約4次，直至無(wú)SO42-析出為止（用BaCl2溶液檢查）。透析完畢后，分別量得適量體積，保存于冰箱中備用。

(3)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：將原提取液及經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到的各分部溶液，用Folin試劑或考瑪斯藍(lán)G—250（參閱實(shí)驗(yàn)56）測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)。

(4)酶活性的測(cè)定：以愈創(chuàng)木酚為底物測(cè)定酶活性。

(5)將結(jié)果填入表中。