（一）原 理

DNA是所有生物體的基本組成物質(zhì)。真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核中。制備DNA時(shí)應(yīng)將細(xì)胞核膜打破方能釋放出來(lái)。

細(xì)胞中的DNA和RNA分別與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成脫氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在細(xì)胞破碎后，這兩種核蛋白將混雜在一起。因此，要制備DNA首先要將這兩種核蛋白分開(kāi)。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀鹽溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脫氧核糖核蛋白的溶解度則最小（僅約為在純水中的1%）；而在l mol/L NaCl的濃鹽溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在純水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度則明顯降低。根據(jù)這種特性，調(diào)整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開(kāi)。因此，在細(xì)胞破碎后，用稀鹽溶液，反復(fù)清洗，所得沉淀即為脫氧核糖核蛋白成分。

分離得到的脫氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸鈉（SDS）使蛋白質(zhì)成分變性，讓DNA游離出來(lái)，再用含有異戊醇的氯仿沉淀除去變性蛋白質(zhì)。最后根據(jù)核酸只溶于水而不溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，加入95%的乙醇即可從除去蛋白質(zhì)的溶液中把DNA沉淀出來(lái)，獲得產(chǎn)品。

當(dāng)細(xì)胞破碎時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核酸酶（DNase）立即開(kāi)始降解DNA，如果在破碎細(xì)胞后不及時(shí)采取抑制酶活的措施，最后將會(huì)得不到任何DNA。為此，如在本實(shí)驗(yàn)中加入檸檬酸鹽、EDTA等螯合劑以除DNase必需的Mg2＋離子，使DNase活性降低，并要求整個(gè)分離制備的過(guò)程均在4℃以下進(jìn)行，以減少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白質(zhì)（包括DNase）變性。當(dāng)然如果希望獲得更大分子的DNA時(shí)，則在細(xì)胞破碎后，及時(shí)加入SDS使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白質(zhì)成為碎片或氨基酸，及時(shí)阻止DNase的降解作用。

DNA分子很大、很長(zhǎng)，在水中呈黏稠狀，但DNA鏈的雙螺旋結(jié)構(gòu)不宜小角度的折疊，使之DNA分子具有剛性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折疊和壓擠等剪切力，將使DNA斷裂成碎片。為保證獲得大分子DNA，操作時(shí)應(yīng)避免急裂振搖，或過(guò)大的離心力。轉(zhuǎn)移吸取DNA時(shí)不可用過(guò)細(xì)的吸頭，不可猛吸猛放，更不能用細(xì)的吸頭反復(fù)吹吸。

大分子DNA的水溶液呈黏稠狀，可以用玻璃棒纏起來(lái)。液體DNA只要防止DNase污染和高鹽濃度條件下能在液體狀態(tài)保存；抽干后的固體DNA，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。

生物體內(nèi)各部位的DNA是相同的，但取材時(shí)以含量豐富的部位為主，如動(dòng)物的肝臟、脾、腎、血液、精子等。所有材料，必須新鮮及時(shí)使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷凍保存。

DNA的含量及純度可用紫外吸收法、定磷法及化學(xué)法等測(cè)定。

（二）試劑及器材

（1） 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0檸檬酸鈉溶液：稱(chēng)取8.77g NaCl，4.41g檸檬酸三鈉（Na3C6H507 · 2H20），用約800ml蒸餾水溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.0，最后定容至1 000ml。

（2） 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液：稱(chēng)取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于約800ml蒸餾水中，以NaOH調(diào)pH至8.0，最后定容至1 000ml。

（3） 5%（W/V）十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液：稱(chēng)取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。

（4） 氯仿– 異戊醇溶液：按氯仿:異戊醇=24:1配制。

（5） pH8.0 TE緩沖液或0.01mol/LNaOH：120mol/L Tris–HCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸餾水至1 000ml。

（6） 95％（V/V）乙醇1 000ml。

（7） 75％（V/V）乙醇1 000ml。

（8） 組織搗碎機(jī)。

（9） 玻璃勻漿器。

（10） 冷凍離心機(jī)。

（11） 冰、粗鹽。

（三）操作

（1） 本實(shí)驗(yàn)以兔肝臟作材料（其他動(dòng)物肝臟也可以）。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將兔饑餓24h以上，以避免糖原的干擾。

（2） 用燒杯（500m1）放1/3體積的冰，加入少量水及約20g食鹽，制成冰鹽水。

（3） 將經(jīng)過(guò)饑餓的兔頸部放血致死，迅速開(kāi)腹取出肝臟，稱(chēng)取約10g浸入預(yù)先在冰鹽水中冷卻的0.15mol/L NaCl–0.015mol/L檸檬酸鈉溶液中。除去脂肪、血/塊等雜物；再用少量溶液反復(fù)洗滌幾次，直至組織塊無(wú)血為止。

（4） 將洗凈的組織剪成碎塊。先加入20m1 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L檸檬酸鈉溶液，放在組織搗碎機(jī)中迅速搗成勻漿，再放入玻璃勻漿器中勻漿2～3次，使細(xì)胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl–0.015mol–L檸檬酸鈉溶液至50ml。

（5） 勻漿液在4℃ 6 000r／min離心15min，棄上清。在沉淀中加入4倍體積冷的0.15mol/L NaCl–0.015 mol/L檸檬酸鈉溶液，攪勻，按上述條件，離心棄上清。如此重復(fù)操作2～3次，盡量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后棄去上清，留沉淀。

（6） 將沉淀物（約5m1）懸浮于5倍體積的pH8.0，0.015 mol/L NaCl–0.1 mol/L EDTANa2溶液中，攪勻，而后邊攪拌邊慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的最終濃度達(dá)1%為止（應(yīng)加多少毫升?），此時(shí)溶液變得十分黏稠，若不黏稠應(yīng)重做，然后，加入固體NaCl使最終濃度達(dá)l mol/L。繼續(xù)攪拌30～45min，以確保NaCl全部溶解，此時(shí)可見(jiàn)溶液由稠變稀薄。

（7） 將上述混合溶液倒于一個(gè)300ml的帶塞三角瓶中，加入等體積的氯仿– 異戊醇，振蕩10min。在室溫3 000r/min離心10min（為什么可以在室溫操作?），此時(shí)可見(jiàn)離心液分為3層：上層為水溶液，中層為變性蛋白塊，下層為氯仿– 異戊醇。小心吸取上層水相，記錄體積，放入三角瓶中，向水相中，再加入等體積氯仿– 異戊醇，振蕩，離心，如此重復(fù)抽提2–3次，除凈蛋白質(zhì)。

（8） 最后1次離心后，小心吸取上層溶液（不要吸取下層氯仿），記錄體積，放入干燥小燒杯中，加入2倍體積預(yù)冷的95%乙醇。加時(shí)，用滴管吸取乙醇，邊加邊用玻璃棒慢慢順一個(gè)方向在燒杯內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，隨著乙醇的不斷加入可見(jiàn)溶液出現(xiàn)黏稠狀物質(zhì)，并能逐步纏繞于玻璃棒上，此時(shí)玻璃棒攪動(dòng)的目的在于把黏稠絲狀物纏在玻璃棒上，直至再無(wú)黏稠絲狀物出現(xiàn)為止。黏稠絲狀物即是DNA。

（9） 將所得的DNA從玻璃棒上取下，用75%乙醇洗2次，置于干燥器中抽干，稱(chēng)取重量，計(jì)算產(chǎn)率。

（10） 按200μg/ml的濃度稱(chēng)取一定量DNA，溶于0.01 mol/L NaOH溶液或pH8.0 TE緩沖液中（干燥DNA不易溶解，應(yīng)在測(cè)定前幾天預(yù)先溶解）。