WB免疫印跡法，也稱(chēng)免疫轉(zhuǎn)移技術(shù)IBT(Immunoblotting)，是Towbin將1975年Southern發(fā)明的Soutnern blotting技術(shù)應(yīng)用于蛋白-蛋白相互作用建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法。其操作簡(jiǎn)便，主要用于未知蛋白檢測(cè)及抗原組分、抗原決定簇鑒定，同時(shí)也用于未知抗體的檢測(cè)和單抗鑒定等，在生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床疾病早期診斷和預(yù)后跟蹤分析方面都有應(yīng)用。
WB實(shí)驗(yàn)中使用到的有三種抗體：一抗、二抗和內(nèi)參抗體。一抗是唯1針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體，可以進(jìn)行制備也可以購(gòu)買(mǎi)現(xiàn)貨，難度系數(shù)較高；二抗直接買(mǎi)就OK，只是需要留意下種屬選擇；內(nèi)參抗體必bi不可少，是WB實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)控環(huán)節(jié)。
那么，在制備抗體或者選擇抗體時(shí)，是不是十分糾結(jié)？今天，遠(yuǎn)慕跟大家聊一聊。
WB檢測(cè)之一抗
一抗制備
如果目的蛋白的現(xiàn)貨抗體沒(méi)有找到，或者都不中意，就需要親自動(dòng)手制備了，請(qǐng)公司幫你做也不錯(cuò)哦！自己制備一抗通常情況下可以選小鼠、兔制備多抗或者選小鼠制備單抗，前者省時(shí)省錢(qián)，后者耗時(shí)耗財(cái)卻各有優(yōu)缺點(diǎn)。多抗制備出來(lái)容易產(chǎn)生雜帶，卻容易出結(jié)果，單抗制備出來(lái)能得到單一條帶及一張漂亮的WB圖片，拿去炫耀下也不錯(cuò)。然而做單抗如果沒(méi)有強(qiáng)有力的細(xì)胞培養(yǎng)、融合、篩選經(jīng)驗(yàn)，也有各種意想不到的結(jié)果。比如完敗，或者只篩到一株卻不能做WB。不過(guò)在每一步實(shí)驗(yàn)中注意細(xì)節(jié)還是可以得到滿意的抗體的。
多抗制備過(guò)程：
第一步：免疫及效價(jià)檢測(cè)。看似只是把抗原打進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)，其實(shí)暗藏玄ji機(jī)，不同的免疫方式效果不一。通常情況下，免疫效果排序如下：皮內(nèi)>皮下>腹腔>靜脈，通常采用皮內(nèi)或皮下免疫。免疫劑量過(guò)多過(guò)少均會(huì)產(chǎn)生免疫耐受，一般小鼠每次每只免疫50 μg共4次，兔每次每只免疫300-500 μg共5次。每次免疫后測(cè)定效價(jià)均要設(shè)置對(duì)照，以排除各種情況導(dǎo)致的ELISA假陽(yáng)性或假陰性。
第二步：取血。小鼠取血通常采用眼球取血，一只小鼠可得到大約1.5 mL的抗血清。兔取血通常采用頸動(dòng)脈取血，一只兔可得到大約25 mL的抗血清。
第三步：抗體純化。單抗的純化使用proteinA/G即可，得到的都是均一性的抗體分子。多抗的純化可以采用proteinA/G或抗原親和純化，后者篩掉了一些非特異性的IgG，留下的都是能與抗原結(jié)合的抗體，所以能在一定程度上避免WB結(jié)果的雜帶問(wèn)題。
單抗制備過(guò)程：
第一步：參照多抗制備的第一步。
第二步：細(xì)胞融合。細(xì)胞在融合的過(guò)程中非常脆弱，所以勁道要輕、時(shí)間要把控好，一般按照標(biāo)準(zhǔn)的融合方案來(lái)，做到能一手畫(huà)圓一手畫(huà)圈，此步需要向郭靖童鞋學(xué)習(xí)，手不要抖則基本達(dá)標(biāo)，可以在融合板里看到很多圓溜溜的單克隆。
第三步：亞克隆。基本上程序化操作，對(duì)細(xì)胞吹打不要太狠就行。
第四步：篩選檢測(cè)。細(xì)胞融合及亞克隆后都要對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行篩選檢測(cè)。細(xì)胞單克隆在生長(zhǎng)過(guò)程中容易因?yàn)橥饬ι⒙涑刹灰?guī)則形狀而影響判斷，或許一個(gè)很好的陽(yáng)性克隆就這么被忽略掉了。所以千萬(wàn)不要讓你的板子磕到了，尤其是融合的細(xì)胞板換液時(shí)更是要極其小心。當(dāng)然，如果不嫌麻煩可以把融合板的單克隆挑到新的細(xì)胞板再進(jìn)行檢測(cè)。
第五步：腹水制備。將篩選的陽(yáng)性單抗細(xì)胞株注射到小鼠腹腔，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間小鼠腹腔會(huì)產(chǎn)生含高濃度單抗的腹水。注射的細(xì)胞數(shù)量不宜過(guò)多或過(guò)少，過(guò)少會(huì)導(dǎo)致不生成腹水或周期過(guò)長(zhǎng)，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致小鼠過(guò)早死亡。一般一只小鼠腹腔注射10^6個(gè)細(xì)胞即可，大約2周即可取腹水。
第六步：參照多抗制備的第三步。
一抗選擇
如果有現(xiàn)貨，就不用花時(shí)間精力再去自己制備啦，快來(lái)get現(xiàn)貨一抗選擇新技能！
①抗體的說(shuō)明書(shū)中明確指明可用于WB檢測(cè)的是shou選。但沒(méi)寫(xiě)不表示不能做，可能廠商沒(méi)有驗(yàn)證，如果確實(shí)需要這個(gè)或者只有這一個(gè)，可以向廠商申請(qǐng)?jiān)囉醚b哦。
②抗體適用的種屬也是需要考慮的。說(shuō)明書(shū)中也會(huì)寫(xiě)明，如果研究樣本的來(lái)源物種不在列表里，也并不代表就不能使用，不過(guò)最好不用。當(dāng)然抗體的適用性與不同物種統(tǒng)一蛋白的序列相似性有關(guān)，用信息學(xué)的方法比對(duì)一下可以預(yù)測(cè)抗體是否可用，如果同源性較高的話還是可以選擇的。
③抗原類(lèi)型也需要審視。免疫原不限于蛋白，菌體或細(xì)胞都可以作為免疫原，在選擇時(shí)要進(jìn)行區(qū)分。比如要檢測(cè)的是蛋白的區(qū)段或同型物，就要選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。
④如果一抗是未標(biāo)記的，后續(xù)還需使用二抗，則選擇的一抗來(lái)源物種與樣本來(lái)源物種要避免相同導(dǎo)致交叉反應(yīng)。比如檢測(cè)大鼠組織內(nèi)目的蛋白，則最好選兔抗鼠的一抗，而不選擇小鼠來(lái)源的一抗。如果一抗是標(biāo)記的，則可以不考慮這個(gè)問(wèn)題。
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