實(shí)驗(yàn)概要
免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表著機(jī)體體液免疫的水平，并進(jìn)一步代表著B(niǎo)細(xì)胞的功能，因此測(cè)定血清Ig含量可以推知機(jī)體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過(guò)高和過(guò)低。本實(shí)驗(yàn)對(duì)禽血清IgG和IgA進(jìn)行了分離純化。
實(shí)驗(yàn)原理
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。隨著免疫學(xué)的發(fā)展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為bi不可少的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數(shù)采用二步法以上相結(jié)合的方法，特別是以硫酸銨提純?yōu)榛A(chǔ)，再經(jīng)過(guò)層析柱的方法來(lái)提高免疫球蛋白及其各成分的純度最為常用。
硫酸銨溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來(lái)(稱為鹽析)。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同，利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提，為了獲得純化的免疫球蛋白成分，必須進(jìn)一步采用層析的方法進(jìn)行分離。
主要試劑
1. 禽血清IgG的分離與提純(Na2SO4法)
1) 5％葡聚糖硫酸鹽
2) 0.02Mol/L MnCl2溶液
3) 無(wú)shui硫酸鈉
4) pH8.2硼酸鹽緩沖液
5) 0.06Mol/L pH7.4PB液
2. 禽IgA提取與純化
1) 禽膽汁
2) 飽和硫酸銨溶液
3) 0.01Mol/L pH7.4PBS液
4) 0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)
5) DEAE52-纖維素
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 禽血清IgG的分離與提純(Na2SO4法)
1) 取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸鹽液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，靜置，然后離心去沉淀，此步目的是為了去掉脂類物質(zhì)。
2) 于上清液中加無(wú)shui硫酸鈉使每毫升血清含0.18g，緩慢加入，混勻，靜置30min，3 000r/min離心去上清。
3) 以pH8.2硼酸鹽緩沖液將沉淀稀釋至原血清的一半再加硫酸鈉使成0.16g／ml，同上法離心去上清。
4) 重復(fù)步驟3，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
5) 以少量硼酸鹽緩沖液溶解沉淀，然后裝透析袋除鹽48h。
6) 過(guò)SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。
7) 如要進(jìn)一步提純，則用第二峰再過(guò)DEAE—纖維素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脫，洗脫下來(lái)的蛋白液即為IgG。
也可以按以下操作方法進(jìn)行：
1) 以18％硫酸鈉(W/V)提取一次，再以14％的硫酸鈉提取一次。
2) 將粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入無(wú)shui硫酸鈉，離心。再將上清按5％加入無(wú)水liu酸鈉，離心。將兩沉淀溶解、混合，在常水中透析過(guò)夜，再在生理鹽水中4℃透析，直至無(wú)SO42-為止。
3) 離心將上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
4) 過(guò)SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脫，收集洗脫液，取第二峰即為雞IgG。
2. 禽IgA提取與純化
1) 取冷藏的膽汁3ml，緩慢滴加1ml飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使成25％飽和硫酸銨液。4℃放置30min。
2) 3000r/min離心30min，去沉淀。
3) 取上清，加飽和硫酸銨液，使成35％的飽和度，4℃放置30min。
4) 3000r/min離心30min，棄上清。
5) 取沉淀，加0.85％NaCl液溶解，加飽和硫酸銨溶液，重復(fù)步驟3和4三次。
6) 將沉淀用0.85％NaCl液溶解，裝入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7) 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，過(guò)DEAE52纖維柱(20×250mm)。
8) 取透析樣品4ml(﹥20mg/ml蛋白濃度)加入層析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫。
9) 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl濃度為0.30Mol/L)洗脫，收集洗脫液。
10) 濃縮洗脫蛋白液至20mg/ml，分裝，低溫冰箱保存。
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