細菌表達蛋白質和樣本制備操作
點擊次數：440 更新時間：2023-02-20
一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解，具體方法如下：
試劑與設備
（1）表達待檢測蛋白質的細菌。
（2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。
（3）2xSDS凝膠加樣緩沖液：
100mmol／L Tris—HCl（pH6.8）
200mmol／L 二硫蘇糖醇（DTT）
4％ SDS（電泳級）
0.2％ 溴酚藍
20％ 甘油
不含有二硫蘇糖醇（DTT）的2XSDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，臨用前須從1mol／L二硫蘇糖醇儲存液現用現加于上述緩沖液中。
（4）臺式離心機。
（5）超聲破碎儀。
（6）水浴箱。
（7）渦漩振蕩器。
（8）加樣器與吸頭等。
操作步驟
（1）表達靶蛋白大腸桿菌經誘導適當時間后，用微量離心機以12 000g離心30s，收集1ml培養的菌體。
（2）吸取培養液，加入0.5ml用冰預冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振蕩沉淀的菌體，使之復懸，用微量離心機于0°C以12000g離心30s回收菌體。
（3）再次吸出上清液，小心地吸凈管壁上的液滴，盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。
（4）加入25μl水，振蕩使沉淀復懸，一旦菌體分散開來，立即加入25μl 2XSDS凝膠加樣緩沖液，繼續振蕩20s。
（5）樣品在沸水浴中放置5min。
（6）采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時處理多個樣品的超聲處理儀對DNA進行剪切，根據所用超聲處理儀的輸出功率及其設定狀態，以最大功率處理0.5—2min應能有效地將裂解液粘度降至可控水平；
（7）樣品于室溫以12000g離心10min，將上清液移至另一管中，棄沉淀物；
（8）吸取經剪切或超聲處理的樣品25μl電泳，剩余樣品保存于—20℃備用。
