上海遠慕生物科技有限公司

　　遇到這種問題常常需要了解酶活性單位是如何確定，我們多次接到這樣的問題：1個單位的酶能在60分鐘內切1ug的DNA,為什么我們的DNA那么少切那么長時間也不能切開或切wan全？ 從下面幾個因素去考慮：

　　1)　酶是否有活性：酶的活性單位通常是在60分鐘酶切1ug lambda DNA或特定線狀DNA所需要的酶量。鑒定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是別的公司的酶來判定。因為不同公司酶可能是從不同系統中純化的，雖然識別位點相同，但是酶的特性可能是有差異的。鑒定酶必須使用使用說明書上認定的酶活確定的方式，通常需要用lambda DAN做模板來判定。同時如果酶對甲基化敏感，還需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于運輸或分裝不當導致酶活性下降，這種情況是很少發生。遠慕銷售的酶，在分裝前嚴格檢驗過，不合格的東西（很少）都退回原廠，所以不合格的產品是不會送到用戶手頭的。

　　2)　模板性質是否清楚：如果 DNA的類型變了所需要的酶量也不同。酶切效果與DNA的性質（線狀，超螺旋狀）、位點數目、位點左右的序列、甲基化程度、純度等有很大的關系。對超螺旋狀DNAwan全酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍(在我們的目錄上有部分酶是有標注的)，同時需要提高酶的用量（10U/ug）和延長反應時間等措施。還有一個問題是有些時候DNA是從別人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。

　　3)　模板純度是否夠：模板制備方式影響DNA的質量，制備過程中使用到乙醇，氯仿，ben酚，SDS, EDTA等如果殘留在最終的DNA模板中，都會不同程度影響酶的活性。Miniprep時如果用試劑盒抽提，需要的問題污染是變性劑和乙醇；如果是手工制備的，氯仿，乙醇，ben酚及細胞內其他雜質都會不同程度的干擾酶活性。

　　4)　甲基化程度對酶的活性是否有影響：細菌中主要有Dcm和Dam兩種甲基化方式，在植物和動物細胞中主要是CG位被甲基化。仔細看看使用的酶對甲基化的敏感情況，或許能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。

　　5)　反應條件是否合適：對照說明書，檢查使用的溫度是否正確，是否需要添加BSA, 是否使用正確的緩沖溶液。由于緩沖液中基本都含有DTT,反復凍融會使模板使DTT降解。注意有些研究人員將buffer長時間放在4度或室溫，這是很不規范的行為。

　　6)　酶稀釋和添加方式是否正確：一般要求在最后加酶，但是對同時做多個相同反應的時候，最后加酶有可能不很方便。通常是將緩沖、酶和適量的水配制成一個混合物，然后分裝，最后加模板。需要提醒的是混合物（Master Mix）中由于沒有底物的存在，離子強度也不對，酶可能要受到損傷。這種提前混合的做法沒有問題，只是動作要快一些，沒有分裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用。